激光共聚焦顯微鏡工作原理

　　激光共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像基礎上加裝了激光掃描裝置，利用計算機進(jìn)行圖像處理，把光學(xué)成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像，在亞細胞水平上觀(guān)察諸如Ca2+ 、PH值，膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強有力的研究工具。激光共聚焦成像系統能夠用于觀(guān)察各種染色、非染色和熒光標記的組織和細胞等，觀(guān)察研究組織切片，細胞活體的生長(cháng)發(fā)育特征，研究測定細胞內物質(zhì)運輸和能量轉換。能夠進(jìn)行活體細胞中離子和PH值變化研究(RATIO)，神經(jīng)遞質(zhì)研究，微分干涉及熒光的斷層掃描，多重熒光的斷層掃描及重疊，熒光光譜分析熒光各項指標定量分析熒光樣品的時(shí)間延遲掃描及動(dòng)態(tài)構件組織與細胞的三維動(dòng)態(tài)結構構件，熒光共振能量的轉移的分析，熒光原位雜交研究(FISH)，細胞骨架研究，基因定位研究，原位實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物分析，熒光漂白恢復研究(FRAP)，胞間通訊研究，蛋白質(zhì)間研究，膜電位與膜流動(dòng)性等研究，完成圖像分析和三維重建等分析。
 

　　基本原理
 

　　傳統的光學(xué)顯微鏡使用的是場(chǎng)光源，標本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì )受到鄰近點(diǎn)的衍射或散射光的干擾；激光共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對標本內焦平面的每一點(diǎn)掃描，標本上的被照射點(diǎn)，在探測針孔處成像，由探測針孔后的光點(diǎn)倍增管(PMT)或冷電耦器件(cCCD)逐點(diǎn)或逐線(xiàn)接收，迅速在計算機監視器屏幕上形成熒光圖像。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì )在探測針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)。