激光顯微鏡的優(yōu)勢

　    激光顯微鏡與傳統寬場(chǎng)顯微鏡相比，具有高清晰度、高分辨率、高靈敏度等特點(diǎn)，在生物醫學(xué)領(lǐng)域應用廣泛，成為了該領(lǐng)域重要的成像工具。為什么共聚焦能得到如此多的寵愛(ài)，它又有哪些優(yōu)勢呢？本文列舉了三方面來(lái)論述共聚焦的優(yōu)勢。

　　只收集焦平面上的信號，使圖像由模糊變清晰

　　樣品比較厚的時(shí)候，普通寬場(chǎng)熒光顯微鏡只能夠觀(guān)察到整體的樣品結構，而共聚焦顯微鏡卻可以展現樣品輪廓及內部結構。

　　那么共聚焦顯微鏡是如何實(shí)現這一優(yōu)勢的呢？這就要歸功于共聚焦的關(guān)鍵硬件—針孔（pinhole），如圖二所示，它是檢測器前面的一個(gè)小孔，放置在與樣品焦面共軛的光學(xué)平面上。當激發(fā)光照射樣品時(shí)，焦面和非焦平面上的樣品區域都會(huì )被激發(fā)而產(chǎn)生熒光信號，調節合適的針孔大?。ㄍǔ? Au），使焦面上的熒光信號（綠色虛線(xiàn)）可以通過(guò)針孔到達檢測器，而非焦平面的熒光信號（紅色和藍色虛線(xiàn)）不能通過(guò)針孔到達檢測器。通過(guò)增加硬件針孔，使共聚焦在不改變普通熒光顯微鏡的制片方法的前提下，得到了清晰的高質(zhì)量圖像。

　　可連續獲取不同焦平面的信號，實(shí)現三維重組

　　由于針孔的存在，我們能夠只獲取到焦平面上的信號，得到高分辨率的二維圖像。連續調節Z軸位置，就能夠得到不同Z軸位置的二維圖像，獲得一系列連續的“光學(xué)切片"圖像。獲得這些光學(xué)切片后，可使用儀器軟件配備的3D模塊進(jìn)行三維圖像的重組，構建出清晰的3D圖像。這種無(wú)損傷的、連續的光學(xué)切片圖像的采集，實(shí)現了“細胞CT"的功能。

　　應用于共定位(Co-localization)研究

　　共定位結果的精準度與圖像的分辨率密切相關(guān)，所以我們在進(jìn)行共定位實(shí)驗時(shí)需要選擇更高分辨率的成像方式。共聚焦顯微鏡相比于傳統顯微鏡以其高分辨率的優(yōu)勢，成為共定位研究的得力工具。

　　由于衍射極限的存在，激光顯微鏡常規共聚焦光學(xué)分辨率在200nm左右，當我們需要觀(guān)察大于200nm的結構時(shí)，共聚焦就能夠準確判斷其共定位程度。如果需要進(jìn)行共定位分析，可以選用共聚焦軟件中配備的共定位分析模塊。