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熒光入門(mén)介紹
熒光是George Gabriel Stokes于1852年shouci報道的一種現象。他觀(guān)察到螢石在紫外線(xiàn)照射后開(kāi)始發(fā)光。熒光是光致發(fā)光的一種形式，是指一種材料被光照射后會(huì )發(fā)射出光子。發(fā)射光的波長(cháng)比激發(fā)光更長(cháng)。這種效應又稱(chēng)為斯托克斯位移。
以熒光為工具在顯微鏡中的應用
熒光在顯微鏡中有著(zhù)廣泛的應用，是觀(guān)察特定分子分布的重要工具。細胞中的絕大多數分子并不會(huì )發(fā)出熒光，因此必須用熒光分子即所謂的熒光素進(jìn)行標記。對于感興趣的分子可以直接標記（例如，用DAPI標記DNA），或者使用可與特異性抗體偶聯(lián)的熒光素進(jìn)行免疫染色。免疫染色時(shí)通常必須對細胞進(jìn)行固定。
熒光顯微鏡還可對活細胞或組織進(jìn)行延時(shí)成像。為此，對于感興趣的蛋白質(zhì)可以使用基因編碼的熒光分子進(jìn)行標記，如GFP（綠色熒光蛋白）。對于感興趣的分子（如Ca2+）還可以使用可逆結合的合成染料（如fura-2）或轉基因天然蛋白質(zhì)（如GFP衍生物）進(jìn)行標記。
圖1：當特定波長(cháng)（激發(fā)波長(cháng)）的光照射到分子上（例如照射到熒光團中）時(shí)，光子會(huì )被分子的電子吸收。然后，電子從它們的基態(tài)(S0)提升到更高的能級，即激發(fā)態(tài)(S1’)。這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為激發(fā)(1)。激發(fā)態(tài)壽命很短(通常為10-9/-10-8秒)，在此期間電子的一些能量會(huì )丟失(2)。當電子離開(kāi)激發(fā)態(tài)(S1)返回基態(tài)(3)時(shí)，它們會(huì )失去在激發(fā)過(guò)程中獲得的剩余能量。熒光團的獲得的能量會(huì )以光子形式釋放，釋放的光子波長(cháng)以比激發(fā)光波長(cháng)更長(cháng)，從而能量更少。這種現象被稱(chēng)為斯托克斯位移。
圖2：COS 7細胞，綠色：無(wú)特征蛋白質(zhì)，GFP，紅色：α-微管蛋白，Cy3，藍色：細胞核，DAPI。感謝中國上海SIBS、CAS、生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所邊瑋提供的圖片。
圖3：小鼠成纖維細胞，綠色：F-肌動(dòng)蛋白，FITC，紅色：微管蛋白，Cy5，藍色：細胞核，DAPI。感謝德國海德堡Max Planck醫學(xué)研究所Günter Giese博士提供的圖片。
圖4：小鼠原代海馬神經(jīng)元細胞，藍色：轉染細胞標記；綠色：肌動(dòng)蛋白，TRITC；紅色：GluA Ampa受體單位，Texas Red；灰色：突觸小泡蛋白，Cy 5
圖5：果蠅幼蟲(chóng)，綠色：RNA結合蛋白，Alexa 488
磷光的機制原理
由于磷光分子發(fā)光的時(shí)間比熒光素長(cháng)得多，因此它們儲存激發(fā)能量的方式肯定有所不同。這種差異的基礎在于兩種形式的激發(fā)能級，即單重激發(fā)態(tài)和三重激發(fā)態(tài)都基于不同的自旋排列。
自旋是電子的一種屬性。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，自旋描述了由電子旋轉引起的角動(dòng)量。電子的自旋方向可以是正方向（+1/2），也可以是負方向（?1/2）。更高能級的自旋配對可以在相互方向上平行或反平行。在反平行自旋配對中，單個(gè)角動(dòng)量相互補償，同時(shí)自旋總值為零。這種自旋排列就稱(chēng)為單重態(tài)。兩種平行自旋互不補償且所得數值不同于零值，在這種情況下，自旋被稱(chēng)為三重態(tài)。
當電子從單重態(tài)激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，就會(huì )產(chǎn)生熒光。但在某些分子中，被激發(fā)電子的自旋可以在一種稱(chēng)為系統間交叉的過(guò)程中轉換為三重態(tài)。這些電子失去能量，直到它們處于三重基態(tài)。這種態(tài)比基態(tài)具有更高的能量，但也比單重態(tài)激發(fā)態(tài)具有更低的能量。因此，電子無(wú)法切換回單重態(tài)，也不能輕易地返回基態(tài)，因為量子力學(xué)只允許自旋總值為零。因此分子被困在其能量狀態(tài)當中。
但從三重基態(tài)到基態(tài)的一些變化有時(shí)還是有可能的。這些變化會(huì )發(fā)射出光子和磷光。由于一次只有少數事件可能發(fā)生，三重基態(tài)呈現為能量?jì)斓男问?，因此能夠在更長(cháng)的一段時(shí)間內發(fā)出磷光。
冷發(fā)光在顯微鏡中的應用
對于顯微鏡，熒光是最為實(shí)用的一種冷發(fā)光。熒光素可以很容易地通過(guò)特定的光源（如燈和濾光系統或激光器）在特定波長(cháng)下激發(fā)，發(fā)射光和激發(fā)光可以通過(guò)波長(cháng)來(lái)加以區分（斯托克斯位移）。
利用熒光成像，實(shí)驗室人員可以對細胞內的分子數量和位置進(jìn)行特征描述。熒光顯微鏡的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)使用幾種熒光素。熒光素只需其激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)不同即可。因此，不同目標分子均可同時(shí)觀(guān)察并開(kāi)展大量的實(shí)驗，例如開(kāi)展共定位的研究等。
圖6：果蠅，幼蟲(chóng)齡期，綠色：Feb211陽(yáng)性神經(jīng)元及其軸突，Alexa 488；紅色：CNS纖維部分（即所有軸突），Cy3；藍色：細胞核，DAPI。感謝德國Eggenstein-Leopoldshafen毒理學(xué)與遺傳基因研究所，Karlsruhe研究所Christoph Melcher博士提供的圖片。
圖7：小鼠腎臟切片，綠色：腎小球和腎曲小管，Alexa 488 WGA；紅色：F-肌動(dòng)蛋白（普遍存在于腎小球和刷狀緣）；藍色：細胞核，DAPI
圖8：新生心肌細胞，黃色：DNA，DAPI；綠色：肌間蛋白，Cy3；紅色：鈣粘蛋白，Texas Red；藍色：肌動(dòng)蛋白，Alexa 633
圖9：熒光顯微鏡下獲得的分裂中期FISH染色染色體。感謝東京大學(xué)前沿科學(xué)研究生院人類(lèi)進(jìn)化實(shí)驗室Yumiko Suto博士提供的圖片。
